借助模板分子H₆E调控, 在水热条件下完成不同HAP微粒的制备。主要原料为分析纯级的四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂• 4H₂O)、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄• 12H₂O), 尿素(CON₂H₄), 均购自成都市科龙化工试剂厂。模板分子为分析纯级环己烷六羧酸(cyclohexane- 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexacarboxylic acid, H₆E), 购自东京化成工业株式会社。

在0.1mol/L Ca(NO₃)₂• 4H₂O溶液中加入H₆E, 使其浓度分别为0、0.5、1、5和50 mmol/L。然后加入适量的Na₂HPO₄• 12H₂O, 保持钙磷比为1.67: 1。再加入0.56 mol/L CON₂H₄, 稀硝酸调节pH为2.5。将溶液转入反应釜, 150℃下反应5 h。洗涤, 烘干, 收集。不同浓度H₆E条件下制备的HAP分别记为HAP0、HAP0.5、HAP1、HAP5和HAP50。

BSA、FN和LYS均为分析纯, 购自上海华兰生物制剂公司。将BSA、FN或LYS分别溶解于双蒸水, 定容制备1 mg/mL的蛋白溶液。

取不同HAP微粒各10 mg置于2 mL离心管中, 分别加入1 mL浓度1 mg/mL的蛋白液。在37℃、97 r/min下吸附24 h。用BCA试剂盒(BCA^TM Protein Assay Kit, 南京建成生物制剂有限公司)测试上清液中蛋白含量, 再根据质量守恒原理计算样品蛋白吸附量。

将吸附了蛋白质的HAP微粒在PBS(0.01 mol/L)中进行体外蛋白释放。在37℃、97 r/min条件下, 按一定时间间隔取样, 之后补入等体积PBS。用BCA法进行蛋白浓度测试, 绘制释放曲线。

分别采用X射线衍射(XRD, Philips PW3040/60)和扫描电子显微镜(SEM, QUANTA200)对制备微粒相组成及表面形貌进行表征; 用粒度分布测试仪(LA-920 HORIBA)和比表面积仪(BET, 3H- 2000BET- A)对微粒的粒径和比表面积进行测试。用红外光谱仪(FTIR, Thermo Nicolet5700)和倒置荧光显微镜(CFM, IX51)对吸附蛋白质后的样品进行表征。

不同浓度H₆E合成条件下, 所获得的样品如图1所示。在合成过程中不添加H₆E时, 产物为带状, 宽3 μ m、长约30 μ m(图1(a)); 当合成体系中H₆E浓度为0.5 mmol/L时, 产物呈短带状结构组装而成的花瓣状, 短带状结构长约10 μ m(图1(b)); 当H₆E浓度为1 mmol/L时, 产物为花椰菜状结构(图1(c)); 可见在合成体系中H₆E能够抑制带状结构沿其长轴方向的生长。当合成体系中H₆E浓度为5 mmol/L时, 产物为绒球状(图1(d)); 当H₆E浓度为50 mmol/L时, 产物为中空结构(图1(e))。翁杰等^[12]前期研究认为, H₆E首先与钙离子螯合形成大小为200 nm的颗粒, 以此纳米颗粒为模板, 在其周围自组装形成表面具有纳米片状结构的HAP微球, 并逐渐形成空心HAP微球。

不同H₆E浓度合成条件下, 产物的比表面积由8.17 m²/g逐渐增大到113.02 m²/g。具体结果见表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同H6E浓度合成条件下产物的比表面积 Table 1 SSA of HAP particles modified by different concentrations of H6E for synthesis Sample SSA/(m2• g-1) HAP0 8.17 HAP0.5 51.83 HAP1 65.05 HAP5 105.20 HAP50 113.02

表1 不同H6E浓度合成条件下产物的比表面积 Table 1 SSA of HAP particles modified by different concentrations of H6E for synthesis

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 合成体系中不同浓度H6E调控下产物的SEM照片Fig. 1 SEM images of products synthesized at various H6E concentrations (a) 0; (b) 0.5 mmol/L; (c) 1 mmol/L; (d) 5 mmol/L; (e) 50 mmol/L

与HAP标准图谱(JCPDS 09-0432)相比, 不同浓度H₆E合成条件下, 产物均为HAP(图2), 但是其结晶度却各有不同。未添加H₆E时, 呈长带状HAP0产物(图1(a))具有较强(300)晶面衍射强度; 随着合成体系中H₆E浓度增加, 产物中带状结构逐渐缩短(图1(b~d)), 产物(300)晶面的衍射强度逐渐减弱。Johnsson等^[13]认为某些小分子(柠檬酸三钠、磷酸枸橼酸盐等)能够选择性地吸附于HAP晶面, 选择性地抑制相应晶面的生长, 对HAP的形貌具有调控作用。Jokić 等^[14]在研究水热反应条件对HAP形貌控制的实验中发现, 通过调整反应体系的pH, 可以使HAP沿着六方晶体c轴方向择优生长, 制备出晶须状的HAP。可见, HAP的形貌与小分子晶面吸附导致的生长抑制和环境参数等因素相关。本实验中, 随着合成体系中H₆E浓度逐渐增大, 产物中带状结构逐渐缩短, 晶粒逐渐细化, 结晶度逐渐降低。综上可知, H₆E的引入不影响HAP的晶相组成, 但显著地影响HAP的晶粒尺寸、晶体生长的取向和产物的形貌。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 合成体系中不同浓度H6E调控下产物的XRD图谱Fig. 2 XRD spectra of products synthesized at various H6E concentrations (a) 0; (b) 0.5 mmol/L; (c) 1 mmol/L; (d) 5 mmo/L; (e) 50 mmol/L

实验采用红外光谱仪(FTIR, Thermo Nicolet5700)对BSA、LYS、FN在HAP颗粒样品上的吸附进行了检测。图3显示了HAP0及HAP0吸附BSA、LYS、FN后的红外光谱图。565、603 cm^-1处为PO₄^3-的弯曲振动峰; 960、1033和1111 cm^-1处^[15]为PO₄^3-的伸缩振动峰。873、1414和1456 cm^-1处的峰源于CO₃^2-替换了HAP晶体结构中的PO₄^3-和OH^-, 这说明形成了AB型含碳HAP^[15]。1505cm^-1和1545cm^-1处是N-H弯曲振动和C-N伸缩振动峰^[5], 证明了蛋白质的存在; 同时, 吸附蛋白后, HAP表面基团的吸收峰没有发生化学位移, 这说明BSA、LYS和FN在HAP表面的吸附以物理吸附为主。

随着合成体系中H₆E的增加, HAP微粒对BSA的吸附性能逐渐减弱(图4(a))。HAP0对BSA吸附性能最强, 达2.39 mg/m²; HAP50对BSA的吸附性能最弱, 仅0.23 mg/m²(单个BSA分子吸附面积为14.0 nm× 4.0 nm, BSA理论最大吸附量为2.52 mg/m^2[16])。说明HAP0微粒单位面积有更多吸附位点; 随着合成体系中H₆E增加, HAP表面吸附位点逐渐减少, 蛋白吸附量随之减少。

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 HAP0及其吸附不同蛋白质后的FT-IR图谱Fig. 3 FT-IR spectra of (a) HAP0, (b) HAP0-BSA, (c) HAP0- LYS and (d) HAP0-FN particles

研究发现^{[17, 18]}, HAP晶体(300)晶面由于富集钙离子而带正电荷。BSA等电点为4.7, 在pH为7时带负电荷, 因此HAP晶体(300)晶面与BSA之间存在静电引力而促进其吸附。在HAP0(图1(a))中带状结构(300)晶面衍射强度最大(图2), 其单位面积正电荷最多, 与BSA之间静电引力作用最强, 因而对BSA的吸附性能最强; 随着合成体系中H₆E逐渐增加, HAP(300)晶面衍射强度逐渐降低, HAP微粒表面正电荷逐渐减少, 与BSA之间静电吸引作用逐渐减弱, 因而对BSA吸附性能逐渐减弱。

FN等电点为5.5, 在pH为7时带负电荷, FN与HAP吸附的机制和BSA与HAP吸附的机制相同。随着合成体系中H₆E的增加, HAP微粒对FN的吸附性能逐渐减弱(图4(b))。HAP0对FN的吸附性能最强, 达5.41 mg/m²; HAP50对FN的吸附性能最弱, 仅为0.41 mg/m²。

然而, 具有不同表面微纳结构的HAP微粒对LYS表现出不同于BSA、FN的吸附行为, 随着合成体系中H₆E的增加, HAP微粒对LYS的吸附性能逐渐增强(图4(c))。HAP0对LYS的吸附性能最弱, 仅0.32 mg/m²; HAP50对LYS的吸附性能最强, 达0.86 mg/m²。(单个LYS分子吸附面积为3.0 nm× 4.5 nm, LYS在材料表面理论最大吸附量为2.02 mg/m^2[16])。说明HAP50微粒单位面积具有更多吸附位点; 随着合成体系中H₆E的增加, HAP表面吸附位点逐渐增加, 蛋白吸附量随之增加。

另外, LYS的等电点在11.0~11.35之间, 在pH为7时带正电荷, 因此HAP晶体(300)晶面与LYS之间存在静电斥力而抑制其吸附。HAP0(图1(a))的长带状结构(300)晶面衍射强度最大(图2), 单位面积正电荷最多, 与LYS分子之间静电斥力作用最强, 对LYS的吸附性能最弱。随着合成体系中H₆E增加, HAP(300)晶面衍射强度逐渐降低, 单位面积正电荷逐渐减少, 与LYS之间静电斥力逐渐减弱, 对LYS的吸附增大。

图4

Fig. 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 三种蛋白质在不同表面形貌的HAP表面的吸附行为Fig. 4 The adsorption properties between HAP particles with different surface morphologies and different kind of proteins (a) BSA; (b) FN; (c) LYS (p< 0.05)

如图5所示, 单位质量的HAP0、HAP50颗粒对BSA和FN的吸附总量相近, 而单位质量HAP50对LYS的吸附总量是单位质量HAP0对LYS吸附总量的37倍(图5-c、图5-f)。说明, HAP50的中空结构对碱性蛋白质具有较大的吸附性能。

图5

Fig. 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 单位质量HAP0和HAP50对不同蛋白质的吸附行为Fig. 5 Adsorption behavior of different proteins on unit mass of HAP0 and HAP50 samples (p< 0.05)

综上可知, HAP颗粒对蛋白质的吸附量并不仅仅随着HAP颗粒比表面积(表1)增大而增大, 而与HAP微粒表面的晶面结构具有直接关系。

蛋白质在HAP微粒上吸附后的体外蛋白质释放实验结果表明: HAP0-BSA、HAP0-FN和HAP0-LYS具有明显突释行为, 前5 h蛋白释放量达到75%以上, 24 h释放量达到95%以上; 载蛋白HAP0.5、HAP1和HAP5微粒表现出逐渐增强的蛋白缓释性能, 前5 h释放量约60%, 蛋白释放速率逐渐降低; 载蛋白HAP50微粒缓释效果最明显, 前5 h释放量在45%左右, 在5 h到168 h范围内呈现缓慢释放的趋势。这说明中空壳层结构HAP50能使释放速度降低, 释放时间延长(图6(a~c)。鉴于红外光谱结果(图3), 蛋白与HAP之间以物理吸附为主, 所以HAP微粒上蛋白释放行为主要决定于其表面的微纳结构。

Wang等^[19]用水热法制备HAP球粒, 载布洛芬HAP球粒释放试验表明: 表面光滑HAP突释现象严重, 而烟花状HAP具有明显布洛芬缓释性能, 认为HAP表面粗糙和多孔结构能有效减缓布洛芬的释放速度。

Sun等^[20]用喷雾干燥法制备HAP中空球粒, 载胰岛素HAP球粒体外释放实验表明: 中空球粒HAP对胰岛素具有缓释作用。在本实验中, 由于空间位阻^[21]、机械锁合等作用, 表面粗糙的HAP与蛋白质之间结合力较强, 因此蛋白释放速度较慢; 相反, 光滑表面HAP微粒与蛋白质分子间结合力较弱, 蛋白突释现象严重。

以上结果表明, HAP微粒表面形貌能明显地调控其表面吸附蛋白质的释放速率。然而HAP表面形貌与晶粒尺寸、结晶度、微孔隙等诸多因素有关, 具体导致HAP表现出不同蛋白缓释行为的因素还有待进一步研究。

图6

Fig. 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 具有不同表面微纳结构HAP载三种蛋白体外释放曲线Fig. 6 The release curves of (a) BSA, (b) FN and (c) LYS from protein-loaded HAP particles with different surface morphologies