1.1.1 试剂及材料

乙酸(天津永晟精细化工有限公司); 壳聚糖(Sigma 公司); 明胶(北京化工厂); 羟基磷灰石(粒径为12 μ m和60 nm, 上海华蓝试剂有限公司); 石墨(上海山浦化工有限公司); 硫酸(北京化工厂); 高锰酸钾(陕西省西安化玻站总经销); 30%过氧化氢(天津永晟精细化工有限公司); 水合肼(洛阳市化学试剂厂)。

1.1.2 仪器

TL01静电纺丝机(深圳通力微纳科技有限公司); 扫描电子显微镜(SEM, Carl Zeiss, LEO-1430VP, Germany); 透射电子显微镜(TEM, JEOL. JEM-2100F, Japan)。

1.2.1 Hummers method制备氧化石墨烯和还原氧化石墨烯

0℃下向盛有5 g石墨和115 mL浓硫酸的500 mL蒸馏瓶中缓慢加入25 g高锰酸钾, 搅拌2 h。然后转移到35℃油浴中回流搅拌过夜。接着加入蒸馏水, 在90℃油浴中加热30 min(黑色变成巧克力色)。此时加入约15 mL H₂O₂, 搅拌30 min后, 过滤, 用去离子水和HCl溶液洗涤至接近中性, 然后在60℃的干燥箱中干燥至恒重, 得到GO。

将GO水溶液加入到有冷凝管的回流装置烧瓶中, 加入一定量的水合肼, 在100℃油浴下搅拌回流24 h, 将得到的产物过滤后用乙醇及去离子水各洗涤3次, 于60℃真空干燥至恒重, 得到还原氧化石墨烯(RGO, 黑色)。

1.2.2 纺丝液的配制

称取一定量的CS溶解在乙酸水溶液中, 搅拌12 h后, 接着加入Gel, 在60℃水浴条件下溶解。然后再加入HA颗粒、GO或RGO粉末, 恒温搅拌30 min, 使HA和GO均匀分散在溶液中, 配置成一定浓度的电纺液。

1.2.3 电纺纤维的制备

将配制电纺液注入到干燥注射器中, 插上磨钝针头, 注射器固定在微量注射泵卡槽中。取20 cm× 30 cm 铝箔固定在接地不锈钢板上作为接收装置, 固定注射器针头和铝箔之间距离为15 cm。调节注射泵速率, 使注射器中溶液能以控制的速度2 mL/h匀速流出, 打开高压电源调节电纺电压, 制备电纺纤维。实验室温度为25℃左右, 相对湿度在45%~55%之间。制备好的纤维均在室温下真空干燥3 d, 除去残留溶剂。

1.2.4 抗菌性能测试

菌种为革式兰阴性菌(大肠杆菌, Escherichia coli)和革式兰阳性菌(金黄色葡萄球菌, Staphylococcus aureus), 从定性和定量两方面来评价Gel/CS/ HA/GO复合纤维的抗菌性能。定性分析采用平板涂布培养法(spread plate method), 而定量分析采用薄膜表面粘附的方法(film adhering method)。抗菌实验分为三组: Gel/CS/HA、Gel/CS/HA/RGO和Gel/CS/HA/GO, 每个实验组均有3个平行样, 结果取平均值。

定性分析: 首先将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌两种菌体分别接种于LB培养基上, 于37℃下进行12 h的活化培养, 用接种环取适量的菌体将它们置于液体培养基中培养12 h得到菌悬液, 再用磷酸盐缓冲液(PBS)把上述两种细菌配制成10 mL浓度为1× 10⁸ cell/mL的菌悬液。然后把样品放在37℃、200 r/min的摇床中培养12 h。最后摇匀、取出100 μ L涂平板, 在37℃恒温培养箱中培养12 h, 观察细菌的生长情况并拍照。

定量分析: 采用样品表面粘附的方法测试样品抗菌率。两种菌株都接种于LB培养基中, 于37℃下培养12 h, 此过程重复3次, 以得到较纯的菌落。取单菌落接种于液体培养基在37℃, 200 r/min的摇床中培养12 h。用磷酸盐缓冲液(PBS)将两种细菌配制成3.0× 10⁷ cell/mL的菌悬液, 分别稀释10³倍。将被测样品放置在培养皿中载玻片上, 培养皿底部加入无菌水, 以防止菌液蒸发。取50 μ L滴于样品表面, 37℃培养12 h, 将菌液移至500 μ L PBS溶液中, 摇匀, 取50 μ L涂布平板, 培养12 h, 即可数出菌落数。样品的抗菌作用可以通过如下计算样品的抗菌率来表示(分别以Gel/CS/HA为对照组, 进行3次平行实验, 以得到平均抗菌率):

Gel作为复合纤维的主要成分, 其浓度是影响复合纤维形貌的主要因素。由图1可知, Gel浓度过低(≤ 5%), 表面张力过小, 出现“ 电喷洒” 现象(图1(a))。随着Gel浓度的增大(10%), 表面张力逐渐增大, 开始有纤维形成, 并出现纤维粘联、珠状物等现象(图1 (b))。当Gel浓度在15%到20%之间时, 电纺纤维较均匀(图1(c, d))。但是Gel浓度进一步增大(25%), 表面张力较大, 电场力不足以克服表面张力, 致使纤维的直径增大, 溶剂挥发变慢, 造成纤维粘联和珠状物的出现(图1(e))。Gel浓度进一步增大到30%时, 电纺液的粘度过大, 电纺过程中溶剂挥发过慢, 造成纤维粘联、纤维扁平化(图1(f))。

图1

Fig. 1

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	图1 不同Gel浓度制备的纤维的SEM照片Fig. 1 SEM images of fibers prepared with a series of Gel concentration (a) 5%; (b) 10%; (c) 15%; (d) 20%; (e) 25%; (f) 30%

本实验主要目的是制备具有抗菌作用的复合纤维, 所以向Gel溶液中添加具有抗菌性能的CS。图2是Gel浓度分别为15%和20%条件下添加CS后的纤维形貌照片。Gel浓度为15%时, 当CS浓度较低, 电纺容易进行且电纺纤维较光滑(图2 (a)); 随着CS浓度增加, 电纺液表面张力增大, 电纺纤维较均匀且直径增大(图2 (b))。Gel浓度为20%时, 加入CS后, 有细小的纤维出现。CS浓度较低时, 有部分纤维粘联(图2(c)); CS浓度增加后, 电纺过程中有珠状物出现(图2(d))。其原因在于CS分子内有氢键作用, 致使其刚性强, 可以增强材料的力学性能, 但同时也增大了电纺液的表面张力, 增加电纺难度, CS的浓度不能过大。所以, Gel浓度为15%, CS浓度为1%时电纺制备的纤维较好。

HA是人体骨骼的主要无机成分, 所以向上述Gel(Gel浓度为15%)和CS(CS浓度为1%)溶液中添加HA颗粒, 可以提高纤维的生物相容性。另外, HA分子的Ca²⁺可以与CS分子的-NH₂中的N发生螯合作用^[24], 从而使得形成的纤维更加均匀。本实验选择了粒径为12 µ m和60 nm的HA颗粒, 主要考察其浓度和粒径对纤维的影响。

当HA粒径为12 µ m时, 考察了HA浓度为2%、5%、8%时对电纺纤维的影响。HA浓度为2%时, 由于HA浓度较小, 电纺液中溶剂的含量相对较高, 电纺过程中, 溶剂没有完全挥发, 形成纤维相互粘联的结构(图3(a))。随着HA浓度增大, 纤维粘联现象逐渐降低, 纤维逐渐光滑均匀(图3(b, c))。12 μ m的HA颗粒在酸性环境下会发生溶蚀现象, 造成HA颗粒细化。可以通过图4明显观察到酸性环境下HA颗粒细化现象, 其平均粒径为(149 ± 29) nm。本实验制备的纤维直径约为1 μ m左右, 所以酸溶蚀过的HA颗粒可以被包覆在纤维中。

图2

Fig. 2

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	图2 不同CS浓度制备的纤维的SEM照片Fig. 2 SEM images of fibers prepared with a series of CS concentration (a) 15% Gel, 0.75% CS; (b) 15% Gel, 1%CS; (c) 20% Gel, 0.75% CS; (d) 20% Gel, 1% CS

当HA粒径为60 nm时, 本实验也考察了HA浓度为2%、5%、8%条件下对电纺纤维的影响。由于纳米颗粒的团聚效应, 纤维的粘联现象比12 µ m的更严重(图3(d, e)), HA浓度增大到8%时, 粘联现象减弱(图3(f)), 但电纺液在电纺过程中出现HA沉降现象。

图3

Fig. 3

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	图3 不同HA浓度和粒径制备的纤维的SEM照片Fig. 3 SEM images of fibers prepared with different HA concentrations and HA particle sizes (a) 2%, 12 µ m; (b) 5%, 12 µ m; (c) 8%, 12 µ m; (d) 2%, 60 nm; (e) 5%, 60 nm; (f) 8%, 60 nm

图4

Fig. 4

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	图4 粒径为12 μ m的HA溶蚀前后的SEM照片Fig. 4 SEM images of HA with a size of 12 μ m, before (a) and after (b) dissolution

由以上结果可知, HA的粒径对复合纤维的形貌影响较大。HA颗粒过小为纳米级时, 出现团聚效应, 电纺液不均一, 致使电纺纤维不均匀。HA颗粒增大到微米时, 团聚效应消失, 电纺液均一, 复合纤维形貌较好。HA颗粒粒径为12 µ m, HA浓度为5%时所制备的复合纤维较佳。

据报道, 电纺液的导电性主要由可离子化盐类型、聚合物类型及其浓度等决定。电纺液中加入一些可电离的物质, 不会改变电纺液的电中性, 但分解生成的正、负离子可明显改变电纺液的电荷密度, 提高导电性, 对电纺纤维的形貌和直径产生明显的影响^{[25, 26]}。本实验中HA浓度增大, 在酸性溶液中溶蚀的HA会增多, 纺丝液中的无机离子浓度增大, 从而增强纺丝液的导电性, 使纤维变细。天然高分子本质上是聚电解质, 如CS在酸性溶液中-NH₂生成-NH₃⁺, 增大电纺液的导电性。在CS和HA的混合电纺液中, 质子化的CS分子中N会与Ca²⁺杂化^[24], 形成络合物, 但不改变电纺液的电荷密度, 所以CS和无机离子本身的反应对可纺性没有影响。然而, CS和无机离子的浓度不同会改变电纺液的导电性, 从而对电纺纤维的直径和形貌产生明显的影响。明胶在其等电点以下带正电荷, 其原理同CS。

本研究目的之一在于制备具有抗菌作用的骨组织工程用支架材料。CS具有抗菌作用, 但其抗菌性较弱, 所以本研究向电纺液中添加了抗菌性好的GO。在Gel浓度为15%, CS浓度为1%, HA(12 µ m)浓度为5%的条件下, 添加GO。图5 是在上述三元复合电纺液中分别添加了2% GO和RGO制备的复合纤维形貌照片, 可见纤维更加均匀。在此条件下通过透射电镜(图6)可以看出无机相被包覆在纤维之中。当这两种物质的浓度进一步增大, 由于含量过大, 致使电纺液浓度过大, 在电纺过程中因溶剂挥发易堵塞针头。

图5

Fig. 5

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	图5 加入GO和RGO的纤维SEM照片Fig. 5 SEM images of fibers with GO and RGO (a) 2% GO; (b) 2% RGO

图6

Fig. 6

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	图6 复合纤维的TEM照片Fig. 6 TEM micrographs of the composite fiber

通过上述实验, 得出优化条件Gel浓度为15%、CS浓度为1%、HA(12 µ m)浓度为5%和GO浓度为2%。在此条件下制备四元复合纤维, 考察其抗菌性能。

2.5.1 对大肠杆菌的抗菌性

为了考察复合纤维对大肠杆菌的抗菌效果, 利用平板涂布法对其进行定性抗菌研究。细菌恒温培养12 h 后, 在Gel/CS/ HA/GO表面, 基本没发现大肠杆菌的菌落(图7(c)), Gel/CS/HA/RGO只有少量的菌落(图7(b))。而在对照样的Gel/CS/HA表面(图7(a)), 已有一些菌落堆积在一起形成菌苔。该结果表明: Gel/CS/HA/GO和Gel/CS/HA /RGO对大肠杆菌均具有较强的抗菌能力, 且Gel/CS/HA/GO对大肠杆菌的抗菌能力较强。同时对抗菌性能进行定量分析发现, Gel/CS/HA/GO对大肠杆菌的抗菌率为100%(图7 (d)), Gel/CS/HA /RGO对其的抗菌率仅为38.6%。这些结果均表明Gel/CS/HA/GO对大肠杆菌具有较强的抗菌性能。

2.5.2 对金黄色葡萄球菌的抗菌性

定性分析复合纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌效果, 细菌在恒温培养12 h后, Gel/CS/HA/RGO表面的菌落与Gel/CS/HA表面的菌落均较多且差异不明显(图8(a, b)), Gel/CS/HA/GO表面的菌落明显减少(图8(c))。研究表明Gel/CS/HA/GO对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌能力。定量分析的抗菌能力见图8(d)。Gel/CS/HA/GO的抗菌率达到73.24%, 而Gel/CS/ HA/RGO的抗菌作用较弱, 只达到3.4%。定量实验结果和定性实验结果相一致, 表明Gel/CS/HA/ GO对金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌性能。

图7

Fig. 7

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	图7 复合纤维对大肠杆菌的抗菌率Fig. 7 The composite fibers antibacterial rate determined by Escherichia coli (a) Gel/CS/HA; (b) Gel/CS/HA/RGO; (c) Gel/CS/HA/GO; (d) Antibacterial rate

图8

Fig. 8

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	图8 复合纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌率Fig. 8 The composite fibers antibacterial rate determined by Staphylococcus albus (a) Gel/CS/HA; (b) Gel/CS/HA/RGO; (c) Gel/CS/HA/GO; (d) Antibacterial rate

在本实验中, 复合纤维的CS含量很少, 其抗菌性主要来自于GO和RGO的贡献。据文献报道, GO和RGO材料均具有抗菌性, 其抗菌机理主要有两种氧化应激和损坏细胞膜。氧化应激是由靶细胞中活性氧簇(ROS)的产生而引起的, 如果细胞中的抗氧化酶不能清除活性氧, 就会损坏细胞大分子中的蛋白、DNA和脂类等, 从而破坏细胞^[27]。另一种抗菌机制是GO和RGO通过其锐利边缘的物理作用给细胞膜造成损伤^[28]。Feng等^[29]发现大肠杆菌与GO的直接作用造成细胞膜的完整性破坏和谷胱甘肽的氧化损失。这表明GO的抗菌作用是因为细胞膜的破坏和氧化应激。且石墨烯基材料的抗菌机制很大程度上取决于纳米材料的表面, 即石墨烯在复合材料中的分散越均匀, 其抗菌效果越好。在本实验中, GO具有较好的亲水性, 确保了其在复合纤维中的分散性, 所以本实验中复合纤维可以表现出较强的抗菌活性^[30]。